结核杆菌侵染破骨细胞对骨质破坏相关因子表达影响的体外研究

【摘要】 目的：建立结核杆菌侵染破骨细胞（osteoclasts,OC）模型,探讨结核杆菌侵染OC后对骨质破坏相关因子表达的影响。方法：采集健康志愿者的外周全血,分离出外周全血中的单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,利用核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）以及巨噬细胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulating factor,M-CSF）诱导使其成为OC,对细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色。将已经构建好的具有卡那霉素（Kana）抗性的H37Rv pMV261-GFP绿色荧光结核菌株进行复苏并加入10%的油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶添加剂（oleic albumin dextrose catalase,OADC）、7H9以及含卡那霉素的结核杆菌专用液体培养基进行培养,放置于37℃的恒温箱中培养至光密度（optical density,OD）值为600nm时的0.5左右备用;以单纯OC培养为空白对照组;用结核杆菌以不同转染复数（multiplicity of infection,MOI）侵染OC 24h,采用MTT比色法检测细胞存活率最高的MOI为后续实验MOI,使用H37Rv以此MOI侵染OC为实验组;荧光显微镜及结核杆菌抗酸染色分别观测实验MOI时结核杆菌转染情况。实时荧光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR）检测非受体酪氨酸激酶（C-src）、蛋白激酶K（cathepsin K,CK）、碳酸酐酶2（carbonic anhydrase 2,CA2）、整合素-β3（integrin-β3）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）的表达情况;免疫组化（immunohistochemistry）检测磷酸化酪氨酸激酶产物（P-src）、CK、CA2、Integrin-β3、MMP-9的细胞表面蛋白表达情况;蛋白免疫印迹（western blot,WB）检测P-src、CK、CA2、Integrin-β3、MMP-9的蛋白表达水平。结果：TRAP染色显示细胞培养15d后90％以上为OC,可以用于进行实验。荧光结核杆菌成功将其OD值培养为600nm时的0.5。MTT比色法结果显示：在MOI为20∶1时细胞存活率最高（P＜0.05）,此为实验组MOI;结核杆菌侵染OC后荧光显微镜显示：MOI为20∶1时,绿色荧光标记的结核杆菌进入OC,说明成功转染OC;结核杆菌侵染OC后抗酸染色结果显示：MOI为20∶1时,被染成红色的抗酸结核杆菌进入OC,说明结核杆菌H37Rv成功转染OC。qRT-PCR、细胞免疫组化、WB检测结果均显示：MMP-9、CK、C-src、CA2、Integrin-β3的表达实验组均高于空白对照组（P＜0.05）。结论：结核分枝杆菌能够转染OC;与空白对照组相比,结核杆菌转染OC的实验组中5种具有骨质破坏作用因子均升高,提示结核骨质破坏可能与此相关,为骨结核疾病诊疗提供新的探索方向。     

宁夏四县城乡居民脑中风危险因素知晓率调查与宣教

目的 调查宁夏4县城乡居民对脑中风危险因素了解程度以及他们对相关卫生保健知识的态度、行为状况,并对脑中风防治知识进行宣教,增强公众防治脑中风的意识.方法 根据整群随机抽样原则于2006-2008年将宁夏4个不同县乡的现住城镇居民和以务农为主的人群作为调查对象,年龄在20岁以上.发放调查问卷,之后就脑中风防治知识进行宣教.结果 收到有效调查问卷3211份,其中对高血压、糖尿病、心脏病、高盐饮食、吸烟、饮酒过度为脑中风危险因素的知晓率分别为45.7%、20.2%、14.3%、3.6%、42.5%、42.0%.统计数据显示宁夏四县城乡居民对脑中风相关卫生知识了解普遍偏低,且因文化程度、民族、年龄不同存在较大差异.宣教后调查对象对上述脑中风危险因素的认识程度较宣教前有了显著提高(P<0.01).结论 宁夏4个县乡居民对脑中风防治知识知晓程度普遍偏低,通过脑中风防治知识的宣教可以极大提高公众对脑中风的防范意识,促进公众的态度和行为向有利于脑中风防治方向转变.     

2019年全国医疗机构医务人员诊疗过程手卫生监测报告

 目的 建立医务人员诊疗过程手卫生监测数据的评价体系。方法 2019年9月1—30日采用手卫生观察员现场调查方法获取综合重症监护病房（ICU）、呼吸内科病区、骨科病区、感染科病区、儿科门急诊、血液透析室医生和护士手卫生执行情况,并统计同期调查科室工作量、手卫生用品消耗量以及医疗机构实际开放床位数,计算手卫生依从率和手卫生用品床日消耗量。结果 共有1 480所医疗机构手卫生调查资料审核合格,应执行手卫生1 353 531次,执行手卫生1 076 639次,正确执行手卫生891 185次,手卫生依从率为79.54%,手卫生执行正确率为82.77%。不同规模医疗机构手卫生依从率为76.26%~82.84%,以实际开放床位数600~899张者手卫生依从率最低;手卫生正确率为81.87%~84.01%,以实际开放床位数≥900张者手卫生正确率最低。调查科室手卫生依从率为76.80%~84.44%,以儿科门急诊手卫生依从率最低;手卫生正确率为81.19%~84.98%,以骨科手卫生正确率最低。五个手卫生时机手卫生依从率为67.59%~89.84%,以接触患者周围环境后手卫生依从率最低;手卫生执行正确率为81.51%~86.76%,以接触患者周围环境后手卫生执行正确率最低。综合ICU、呼吸内科、骨科、感染科手卫生用品消耗量分别为56.62、10.76、9.50、14.54 mL/床日,儿科门急诊、血液透析室手卫生用品消耗量分别为2.02、9.06 mL/人次。不同规模医疗机构中,综合ICU以实际开放床位数600~899张者手卫生用品消耗量最多（61.15 mL/床日）,呼吸内科、骨科、感染科均以实际开放床位数>900张者手卫生用品消耗量最多（分别为13.61、10.96、16.55 mL/床日）,儿科门急诊、血液透析室均以实际开放床位数300~599张者手卫生用品消耗量最多（分别为2.53、10.76 mL/人次）。结论 此次调查获取的不同规模医疗机构手卫生依从率及手卫生用品床日消耗量可作为标杆,为各医院机构提供手卫生执行情况的对照体系,以促进全国医疗机构手卫生持续改进。     

HRZ三联抗结核药/TGF-β1 siRNA纳米脂质体对体外BCG感染的人巨噬细胞中Ag85A及TGF-β1表达的影响

目的:探讨异烟肼、利福平、吡嗪酰胺(HRZ)三联抗结核药/表皮转化生长因子(TGF)-β1 si RNA纳米脂质体对体外BCG感染的人巨噬细胞中Ag85A及TGF-β1表达的影响。方法:体外培养人单核细胞株THP-1诱导分化成巨噬细胞,分为4组,空白组为单纯巨噬细胞培养;模型组为巨噬细胞与卡介苗(bacillus calmetteguerin,BCG)以1∶5的比例共培养3h,制备BCG感染的巨噬细胞模型;对照组为BCG感染的巨噬细胞与HRZ三联抗结核药纳米脂质体共培养;实验组为BCG感染的巨噬细胞与三种不同浓度的HRZ三联抗结核药/TGF-β1 si RNA纳米脂质体(C1组为35mg/ml,C2组为40mg/ml,C3组为50mg/ml)共培养。采用RT-PCR检测各组人巨噬细胞中Ag85A及TGF-β1的mRNA表达量,Western-blot方法检测Ag85A及TGF-β1的蛋白表达量。结果:与空白组相比,模型组Ag85A和TGF-β1的m RNA及蛋白量表达明显上调(P0.05);对照组中Ag85A的mRNA及蛋白量和TGF-β1的mRNA水平与模型组相比明显下调(P0.05);实验组3种不同浓度(C1组、C2组、C3组)HRZ三联抗结核药/TGF-β1 si RNA纳米脂质体处理后,Ag85A和TGF-β1的mRNA及蛋白表达量与模型组和对照组相比进一步下调(P0.05),随着纳米脂质体浓度的增加,Ag85A和TGF-β1 m RNA及蛋白表达量有明显下降趋势,C1组与C3组相比Ag85A m RNA及蛋白表达量差异有统计学意义(P0.05);C1组与C2组、C3组相比TGF-β1 mRNA及蛋白量表达差异有统计学意义(P0.05);C2组与C3组相比Ag85A m RNA和TGF-β1蛋白表达量差异有统计学意义(P0.05)。结论:HRZ三联抗结核药/TGF-β1 si RNA纳米脂质体对体外BCG感染的人巨噬细胞具有明显的下调Ag85A基因表达作用及TGF-β1基因沉默作用。     

结核杆菌裂解物刺激后的成骨细胞来源外泌体对破骨细胞的影响

目的:研究结核分枝杆菌裂解物(MTL)刺激后的成骨细胞来源外泌体(MTL-OB-Exo)对破骨细胞形成的影响。方法:采用细胞增殖与毒性实验(Cell Counting Kit-8,CCK-8)确定MTL的最佳剂量为35.9ng/ml,用最佳剂量的MTL刺激小鼠成骨细胞,采用差速离心法分离、提取MTL-OB-Exo和正常小鼠成骨细胞来源外泌体(OB-Exo),经透射电镜观察其形态及大小,采用蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测外泌体跨膜蛋白CD9和成骨细胞特异性碱性磷酸酶(AKP)的表达。将小鼠破骨细胞的前体细胞单核巨噬细胞(RAW264.7),按不同的干预方式分为三组:实验组,MTL-OB-Exo(10ng/ml);对照组,OB-Exo(10ng/ml);空白组,不予任何处理。培养4d后,在光学显微镜下观察RAW264.7的分化情况,并采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色法(tartrate resistant acid-phosphatase,TRAP),观察各组破骨细胞的形态并计数,比较破骨细胞形成的数量。同样的分组条件下,将干预后的细胞在骨磨片上培养10d,采用亚甲蓝染色,观察各组骨吸收陷窝的形态并计数,比较骨吸收陷窝形成的数量。结果:MTL-OB-Exo为直径30～100nm的圆形或椭圆形结构,高表达CD9和AKP蛋白。采用不同的方式对RAW264.7进行干预后,实验组破骨细胞形成的数量为39.60±1.95个,显著高于对照组(30.20±1.64个)和空白组(28.80±1.58个),差异有统计学意义(P0.05);实验组骨吸收陷窝数量为21.40±1.52个,显著高于对照组(16.20±1.30个)和空白组(14.40±1.52个),差异有统计学意义(P0.05)。结论:MTL-OB-Exo可以诱导并增强破骨细胞的形成,造成骨质破坏。     

异柠檬酸脱氢酶1与突变体重组慢病毒的制备及表达

目的:制备异柠檬酸脱氢酶1野生型(IDH1)和RI32H突变型(muIDH1)基因重组慢病毒,感染人胶质瘤来源的细胞系U87细胞并观察目的基因的表达。方法:利用基因克隆技术构建IDH1和mulIDH1基因重组慢病毒载体pLVX-IDH1-mCMV-ZsGreen-PCK Puro和pLVX-mutIDH1-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro,转染293T细胞,进行慢病毒包装,获得慢病毒颗粒;慢病毒颗粒感染HEK293细胞,采用逐孔稀释滴度测定法测慢病毒滴度;IDH1和mutIDH1基因重组慢病毒感染U87细胞,观察感染效率,WesternBlot检测IDH1和mutIDH1基因在U87细胞的表达。结果:成功制备IDH1和mutIDH1基因重组慢病毒颗粒,病毒滴度均为1.0×10^8TU/ml;感染U87细胞,Westerm Blot结果显示:/DHI组中IDH1蛋白水平高于muIDH1组和空载体对照组;mutIDH1组中mu-tIDH1蛋白条带清晰,表达量高,IDH1组和对照组均不表达mutIDHl蛋白。结论:成功制备IDH1和mutIDH1基因重组慢病毒,感染U87细胞后能使目的基因表达。